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    有關物質中誤判雜質峰及形成機制的研究

    發布時間:2022-09-22
    作者:樂美天
    閱讀次數:322
    文章字數:4034

    摘要:分析高效液相色譜法檢查有關物質時容易被誤認為是雜質的峰,并進一步研究其形成機制。

    方法:結合日常檢驗工作和相關文獻,對易被誤認為是雜質峰進行研究總結。

        根據藥品注冊的國際技術要求中雜質的含義,雜質分為有機雜質、無機雜質和殘留溶劑。有關物質是雜質的一種,主要是指有機雜質,它可能是原料藥合成過程中帶入的原料藥前體、中間體、試劑、分解物、副產物、聚合體、異構體以及不同晶型、旋光異構的物質,也可能是制劑過程或是在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解物。

       目前,有關物質的檢查方法很多,主要有薄層色譜法、高效液相色譜法(HPLC法)、氣相色譜法和紫外分光光度法等。其中,HPLC法由于分離效果好、專屬性強、靈敏度高,在有關物質檢查中最為常用。在采用HPLC法對藥物進行有關物質分析時,一般要求考察最大雜質峰面積或各雜質峰面積的和,將其與對照溶液的主峰面積(主成分自身對照品法)或總峰面積(面積歸一化法)比較,規定應不超過某一特定的數值。但在實際檢驗過程中,排除配樣引進或者是柱子沒沖干凈這些因素外,色譜圖上仍然會出現保留時間較弱的峰,易被誤認為是雜質峰,從而造成結果的誤判。筆者結合日常檢驗工作和相關文獻,選取了幾個具有代表性的品種,將這些易被誤認為是雜質峰的峰歸納為溶劑峰、有機酸鹽峰、無機酸鹽峰和輔料峰,并對這些峰的形成原因進行分析,以期對藥物的有關物質HPLC方法的研究和常規檢查提供參考。

    溶劑峰

        在HPLC法中,由于溶解對照品或供試品的溶劑和流動相在某一波長的吸光值不一樣,因此產生了吸光值的變化,表現為出現溶劑峰。溶劑峰可能是正常形狀的峰,也可能是倒峰,還有可能是一組奇形怪狀的峰。減小該類溶劑峰最有效的方法是使用流動相作為溶劑溶解樣品,這樣既可以避免樣品溶劑和流動相之間任何強度或黏度的不匹配,也可以減少樣品分析時基線的漂移。此外,值得注意的是,在進行有關物質分析時,要等基線平穩后,再進溶劑。一般進樣2次,計算供試品溶液的雜質峰時,溶劑峰位置的峰是不參與計算的。

    有機酸鹽峰

       《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2 0 1 5年版(二部)采用H P L C法對苯磺酸氨氯地平的有關物質進行控制。以甲醇-乙腈-0.7%三乙胺溶液(取三乙胺7.0 mL,加水至1000 mL,用磷酸調節pH值至3.0±0.1)(35:15:50)為流動相,色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱,檢測波長為237 nm。標準規定:氨氯地平雜質I峰的峰面積乘以2與其他各雜質峰面積的和應不得大于對照溶液主峰面積的1.5倍(1.5%)。實際檢測時,氨氯地平的出峰時間為17.5 min,但是在溶劑峰出峰的位置有響應較高的峰(保留時間3.0 min),色譜圖見圖 1。若將該峰判定為雜質峰,則會出現有關物質超標的情況。將苯磺酸配制成一定濃度進樣后最終確定該峰為苯環酸的峰。也有研究采用液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用對苯磺酸的出峰予以確證。苯磺酸為一元有機酸,其pKa為0.7,在通常的流動相pH范圍內,苯磺酸氨氯地平主要解離為氨氯地平陽離子(被質子化)和苯磺酸陰離子(C6H5SO3-),因此,苯磺酸氨氯地平會出現兩個峰,一個是苯磺酸(保留時間較短)一個是氨氯地平。

    同時,紀宇等研究表明,采用反相HPLC法同時測定復方感冒藥中的多種成分時,對馬來酸氯苯那敏色譜峰的識別易出現判斷錯誤,將馬來酸的峰誤認為是馬來酸氯苯那敏。馬來酸為二元有機酸,其pKa分別為2.00和6.26,在通常的流動相pH范圍內,馬來酸氯苯那敏主要解離為氯苯那敏陽離子(被質子化)和馬來酸陰離子(HOOCCH=CHCOO-),因此,馬來酸氯苯那敏也會出現兩個峰。

     

          在色譜系統開發過程中,一般會調節流動相pH,與目標化合物pKa相差2個單位以上,使藥物全部解離或結合,這樣才能準確定量。對于帶有機酸根的化合物的液相檢測,比如馬來酸氯苯那敏、富馬酸喹硫平、苯磺酸氨氯地平,在選擇的流動相pH條件下,若目標化合物以離子型存在,則馬來酸、苯磺酸和富馬酸等有機酸也會以鹽的形式存在,這些有機酸因含有共軛結構均有紫外吸收,從而在液相條件下也會出現一個色譜峰。因此,做此類物質的有關物質和含量測定時就應注意,不應將有機酸的峰誤認為是雜質峰,或者是將有機酸的峰誤認為是目標化合物的峰,造成結果的誤判。

    無機酸鹽峰

      《中國藥品標準》采用HPLC法檢測鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的有關物質。以硫酸銅D-苯丙氨酸溶液(取D-苯丙氨酸1.32 g與硫酸銅1 g,加水1000 mL溶解后,用氫氧化鈉試液調節pH值至3.5)-甲醇(82:18)為流動相,檢測波長為293 nm。標準規定,供試品溶液色譜圖中如有雜質峰,各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積。實際分析時,在3.3 min出現一個很大的峰,色譜圖見圖 2。經過分析,認為與鹽酸稀釋后進樣的峰位相同,因而在計算有關物質時不應將該峰誤認為是雜質峰。

           筆者在參與針對新版藥典用的氫溴酸右美沙芬化學對照品的標化工作中,參照《中國藥典》 2010年版(二部)氫溴酸右美沙芬膠囊含量測定的方法,對氫溴酸右美沙芬進行有關物質檢查,流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(取磷酸和三乙胺各5 mL,加水至1000 mL)(28:72),檢測波長220 nm,實際檢測時發現在2.5 min出了一個很大的色譜峰。為了驗證該峰,用溴水稀釋后直接進樣分析,結果在同樣位置出峰。見圖 3。因此,在結果判定時,應注意不要誤將該峰歸納入雜質峰。

        類似于含有有機酸的藥物,含有無機酸的藥物在通常的流動相pH條件下也均會發生解離,以鹽形式存在的化合物進入液相系統后會以游離堿的形式存在,鹽酸和氫溴酸是強酸,也在流動相里解離形成氯離子和溴離子。肖欣等在對不同水中氯離子含量的比對分析中,用1 cm的石英比色皿,取一定濃度的氯化鈉標準溶液作為待測液,采用紫外-可見分光光度計,掃描范圍280~350 nm,確定了氯離子在波長為308.7 nm左右處有最大吸收。呂偉等研究也驗證了溴離子在200~220 nm波長范圍內有較強的紫外吸收。分析原因,可能是氯離子和溴離子有8電子的穩定結構而導致紫外吸收,具體原因還有待進一步分析。

    輔料峰

        藥用輔料是指在藥品制劑中經過合理的安全評價的不包括有效成分或前體的組分。例如,在配制注射劑時,可以根據藥物的性質加入適宜的輔料,如滲透壓調節劑、pH值調節劑、增溶劑、組溶劑、抑菌劑和抗氧劑等,注射劑中所用到的輔料應在標簽及說明書中說明。對于在HPLC法中會出峰的輔料,在對藥物進行有關物質檢測時,應扣除輔料峰的影響。

     

     《中國藥典》2015年版(二部)收載了利巴韋林原料及利巴韋林注射液,標準規定利巴韋林原料及其注射液中單個雜質的峰面積應不得大于對照溶液主峰面積的0.25倍(0.25%),各雜質峰面積的和應不得大于對照溶液的主峰面積(1.0%)。研究發現,采用《中國藥典》的方法檢查利巴韋林注射液的有關物質時,對于加有氯化鈉的利巴韋林注射液而言,氯化鈉會在利巴韋林的雜質峰處同樣出現吸收峰。文獻報道,氯離子在200~220 nm范圍內有較弱的紫外吸收,而且氯離子在磺酸型陽離子交換柱上存在離子排斥,故氯化鈉在色譜柱上基本不保留,對有關物質檢查干擾很大,故在有關物質檢測時應排除氯化鈉峰的影響,或者建議企業在利巴韋林注射液的處方中標注氯化鈉的量或不加氯化鈉以利于檢測。

     

     

    同時,王琳等在對硝酸甘油片有關物質研究中,建立了液質聯用法確證了色譜圖中保留時間2.8 min前的色譜峰為聚維酮K29/32的輔料峰,解決了硝酸甘油片質量標準中有關物質輔料峰的判定和扣除問題。在扣除輔料峰后,3批硝酸甘油片樣品的有關物質結果均符合規定,為《中國藥典》中硝酸甘油片質量標準修訂提供了參考。

     

    此外,《中國藥典》2010年版二部收載的阿奇霉素分散片的有關物質檢驗明確規定了計算時予以扣除相對保留時間0.12之前的色譜峰為輔料峰,必要時應取輔料進行對照。王文笙等研究也表明,羅紅霉素分散片中的輔料糖精鈉的保留時間受儀器、色譜柱、流動相配比影響不大,在一定的流速范圍內只根據保留時間就能很好地對其進行定性,在做有關物質檢查時可以直接將其扣除。

     

    國家藥典委員會藥典業化函8號文對雜質峰的問題作了如下規定:“雜質峰不包括溶劑峰和確認的輔料峰,藥品說明書應列出制劑中所用輔料名稱”。按照理解,已被確認的輔料峰在有關物質判定時不被認為是雜質峰,可以將其扣除。但將其扣除前必須對其進行研究,以確認其確實為某種輔料峰,而非輔料中的雜質峰,如無法確認是何種輔料則無法扣除。筆者建議,在制劑的有關物質方法開發中,也可以避開輔料存在的吸收波長,同時選取主成分和各雜質的特征波長,使輔料無吸收或有較低吸收,以消除或降低輔料峰的干擾;或者更改提取溶劑,利用藥用輔料和主藥的溶解性差異,在充分了解輔料和主藥理化性質的情況下更換提取溶劑,將輔料峰降至最低干擾,以便可以忽略不計

    結語

       藥物中有關物質的研究是藥物研發和質量控制的一個重要方面,貫穿于藥品研究、生產和儲存的整個過程。這就要求分析工作者對檢驗過程中出現的雜質峰予以重視,以免出現錯誤的結果。只有這樣,才能真正使HPLC法測定有關物質的檢驗數據準確、可靠。


    來源:王麗 江蘇省無錫市藥品安全檢驗檢測中心 中國藥事

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